Ilter, Ayca ZeynepArmagan, Fatma Zehra2022-02-082022-02-0820222022https://hdl.handle.net/20.500.12713/2479Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (Kİ-MKH'lar) yüksek rejenerasyon kapasitesi ve immünmodülasyon özelliği sayesinde hücresel tedavilerde sıklıkla kullanılan teröpatik etkinliğe sahip hücreler olarak bilinmektedir. Mezenkimal kök hücrelerin doğal öldürücü (NK) hücreler üzerinde immün baskılayıcı etkileri olduğu bilinse de yapılan bazı çalışmalar önceden aktive edilmiş NK hücrelerinin farklı oranda MKH'lar ile kültüre edildiğinde, NK hücrelerinin sitokin salınımını arttırarak MKH'lar üzerinde sitotoksik bir etkisi olduğunu göstermiştir. Bu sebeple MKH ve NK hücreleri arasındaki etkileşim tam olarak aydınlatılamamıştır. Yapılan bu çalışmada bir gen düzenleme aracı olan lentiviral vektörler kullanılarak Kİ-MKH'larda CD47 protein seviyesi aşırı ifade edilerek önceden aktive edilmiş sitotoksik NK92 hücrelerinden kaçan Kİ-MKH'lerinin oluşturulması amaçlanmıştır. Oluşturulan hücre hatlarında yüzeyde bulunan CD47 protein seviyesi akış sitometrisi ile belirlenirken total protein seviyesi Western emdirimi yöntemi ile belirlenmiştir. CD47 aşırı ifade eden Kİ-MKH'ları sitotoksik NK92 hücreleri ile farklı oranlarda ko-kültüre edilmiş ve morfolojik olarak sağ kalım oranları belirlenmiştir. MKH'larda yapılan lentiviral aracılı genetik modifikasyonun hücrelerde oluşturabilecek kanserleşme potansiyeline karşılık uyarılabilir kaspaz-9 (iC9) proteinine dayalı intihar sistemi kullanılarak kontrol edilebilir Kİ-MKH hattı oluşturulmuştur. Oluşturulan iC9-GFP Kİ-MKH'ların spesifik bir kimyasal dimerizasyon indükleyicisi (CID) ile muamele edilerek hücrelerdeki apoptoz düzeyi Annexin-V/PI boyaları kullanılarak akış sitometrisi ile belirlenmiştir. Yapılan genetik modifikasyonlar sonucunda Kİ-MKH'lerin karakterizasyon analizi qPZR ile gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak, lentiviral vektörler ile CD47 proteinin aşırı ifade eden Kİ-MKH'ların önceden aktive edilmiş sitotoksik NK92 hücrelerinden kaçabildiği gösterilmiş ve iC9 proteinine dayalı intihar sistemi geni aktarılan Kİ-MKH'ların CID kullanılarak seçici olarak apoptoza gittiği kontrol edilebilir MKH'lar oluşturulmuştur.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) are frequently used in cellular therapies, due to their high regeneration capacity and immunomodulation potential. Accumulating evidence showed that mesenchymal stem cells have immunosuppressive effects on natural killer (NK) cells however NK cells may exert cytolytic activity on MSCs when they pre-activated with IL-2 and subsequently co-cultured with MSCs in different ratios. A very recent study displayed that induced pluripotent stem cells could escape from cytotoxic NK cells when they overexpressed CD47 protein on their cell surface. In the light of these evidence the aim of this thesis is to generate BM-MSCs which can escape from cytolytic activity of NK cells. For this purpose, CD47 protein is overexpressed (CD47 o/e) in BM-MSCs by using lentiviral vectors and CD47 protein levels in BM-MSCs were characterized by using flow cytometry, qPCR and Western blot analysis. CD47 o/e BM-MSCs were co-cultured with IL-2 induced NK92 cells with different ratios and survival rates were determined morphologically. Lentivirus mediated gene transfer methods have still safety concerns therefore inducible Caspase 9 based suicide gene system is delivered to wild type BM-MSCs to create a controllable BM-MSC model. Apoptosis levels of successfully iC9 suicide gene delivered BM-MSCs were analyzed by Annexin-V/PI staining following an induction with a specific chemical dimerization inducer (CID). Finally mesenchymal stem cell marker expression of genetically modified BM-MSCs' was determined by quantitative PCR. Results from this study showed that, CD47 o/e BM-MSCs can escape from IL-2 induced cytotoxic NK92 cells, and apoptosis of iC9 based suicide gene delivered BM-MSCs can be selective induced by CID.trinfo:eu-repo/semantics/openAccessMezenkimal Kök HücreGen Düzenlemeİmmun SistemCD47İkaspaz-9Mesenchymal Stem CellGene EditingImmune SystemCD47Icaspase9Master Thesis