Valproik asit ve spironolakton kombinasyonunun akciğer kanseri hücre soylarında sitotoksik/apoptotik etkilerinin araştırılması

Abstract

Kanser hastalarının dünya genelinde ölüm oranları incelendiğinde akciğer kanseri özellikle erkek bireylerde başı çekmektedir. Hayatta kalma süresi erken dönemde (5 yıl) %60-70 iken ileri evrelerde %5'in altına düşmektedir. Akciğer kanseri için kullanılan tedavi yöntemleri ise cerrahi, kemoterapi, radyoterapi ve immünoterapidir. Bu alanlardaki ilerlemeler klinik sonuçlarda iyileşmeler göstersede; terapötik etkinlik tatmin edici değildir. Gelişen araştırma olanaklarını takiben kansere etkisinin zannedilenden çok daha fazla olduğu görülen epigenetik mekanizmalar, kanser tedavisinde yeni bir dönemin başlamasını sağladı. Epigenetik süreçlerin bozulması gen fonksiyonunun değişmesine ve malign hücresel transformasyona yol açabilir. Histon modifikasyonları kanser gelişiminde oldukça önemli bir yere sahiptir.Valproik asit (VPA) etkili bir HDACi (Histon Deasetilaz inhibitörü)’dür ve klinikte kullanılan FDAonaylı bir anti-epileptik ajandır. VPA’nın, çeşitli in vitro ve in vivo sistemlerde güçlü antitümör etkiler sergilediği gösterilmiştir. Erken klinik çalışmalarda, tek başına veya kombinasyon halinde (demetile edici ajanlar ve/veya sitotoksik ajanlarla) kullanıldığında olumlu sonuçlar verdiği rapor edilmiştir. Spironolakton (SP) klinikte özellikle kardiovasküler hastalıkların tedavisinde kullanılan ve aldosteron-antagonisti olan bir ajandır. Kanser alanında ise Spironolakton, DNA hasar yanıtını bozarak kanser kök hücrelerinin büyümesini engellediği bildirildi. Bu tez kapsamında ise gerçekleştirilen literatür taramaları sonucunda Valproik asit ve Spironolakton kombinasyon tedavisi üzerine herhangi bir çalışma ile karşılaşılmamış olup, ilk olarak Valproik asit (0.3-5mM) ve Spironolakton (3-50µM) tek başlarına ve/veya birlikte kullanılarak doz-yanıt çalışmaları yapılmıştır. Bu amaçla, A549 ve H1299 akciğer kanseri hücreleri ajanların ilgili dozları ile 48-72 saat muamele edildi ve hücre canlılığı Sulforhodamine B (SRB) metodu ile değerlendirildi. İlaç etkisini (sinerjistik, aditif veya antagonistik) değerlendirmek için kombinasyon indeksi CalcuSyn programı ile analiz edildi. Sitotoksik etki gözlenen doz(lar)da hücre ölüm modunun analizi için flow sitometri (akış sitometri) ile de Annexin-V-FITC pozitifliği, Mitokondri Membran Potansiyeli ve Kaspaz 3/7 aktivitesi değerlendirilmiştir. Daha sonra ise yara iyileşmesi (wound healing) metodu ile kombinasyon tedavinin hücrelerin migrasyon (göç) yeteneği üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Sonuçlar incelendiğinde VPA-SP kombinasyonunun her iki hücre soyunda da sinerjik etki gösterdiği ve apoptozisi tetiklediği gözlendi. Yara iyileşmesi sonuçlarına göre ilaçların ilgili dozlarının tek ve/veya kombinasyon tedavilerinin herhangi bir anti göç etkisi göstermediği saptanmıştır. Bu çalışma Valproik asit ve Spironolakton ikilisinin kombinasyon şeklinde kullanımının alternatif bir tedavi modeli olabileceğini ortaya koymuştur.

When the death rates of cancer patients around the world are examined, lung cancer takes the lead especially in male individuals. While the survival rate is 60-70% in the early period (5 years), it falls below 5% in the advanced stages. The most commonly used treatment methods for lung cancer are surgery, chemotherapy and immunotherapy. Although advances in these areas show improvements in clinical outcomes, the therapeutic efficacy is unsatisfactory. Following the advancing research possibilities, epigenetic mechanisms, which have been seen to have a much greater effect on cancer than expected, initiated a new era in cancer treatment. Disruption of epigenetic processes can lead to alteration of gene function and malignant cellular transformation. Histone modifications are epigenetic mechanism and have a very important place in cancer development. Valproic acid (VPA) is one of the most effective epigenetic agents as HDACi (Histone Deacetylase inhibitor) and a FDA-approved anti-epileptic used in the clinic. It exerts strong antitumor effects in various in vitro and in vivo systems. It has been reported in early clinical studies that VPA has promising results used either alone or in combination (demethylating and / or cytotoxic agents). Spironolactone is an aldosterone-antagonist agent used clinically, especially in the treatment of cardiovascular diseases. It has been reported that Spironolactone inhibits the growth of cancer stem cells by disrupting the DNA damage response. There is no study in the literature that encounter cytotoxicity of Valproic acid and Spironolactone combination therapy. Thus, in the present thesis, the differential doses of Valproic acid (0.3-5mM) and Spironolactone (3-50µM) are combined for dose-response analysis. For this purpose, A549 and H1299 lung cancer cells are treated with the relevant doses of the agents for 48-72 hours and cell viability is evaluated by Sulforhodamine B (SRB) method. The combination index analyzed by the CalcuSyn program to evaluate the drug efficacy (synergistic, additive or antagonistic). Annexin-V-FITC positivity, Mitochondrial Membrane Potential and Caspase 3/7 activity is then evaluated by flow cytometry (flow cytometry) for cell death analysis at the cytotoxic dose (s). The effect of combination therapy on migration ability of cells is investigated by wound healing method. Results exerted that the combination of VPA-SP exhibits synergistic effect and triggers apoptosis in both cell lines. According to the wound healing results, it was determined that the single and/or combination treatments of the relevant doses of the drugs did not show anti-migration effect. This study revealed that the use of Valproic acid and Spironolactone in combination may become an alternative treatment model in lung cancer.